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    公开号:WO1989001513A1
    申请号:PCT/JP1988/000815
    申请日:1988-08-18
    公开日:1989-02-23
    发明作者:Yoichi Kobayashi；Muneki Omori；Chikako Yamada
    申请人:Sagami Chemical Research Center；Central Glass Company, Limited；Hodogaya Chemical Company, Limited；Nippon Soda Co., Ltd.；Nissan Chemical Industries, Ltd.；Tosoh Corporation；
    IPC主号:C12N9-00
    专利说明:
    [0001] 明 細 速効性プロウ口キナーゼ 醫
    [0002] 本発明は速効性を有するヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ ぺ プチ ド、 該ポリ べプチ ドをコ一 ドする D N Aセグメ ン ト、 該 D N Aセグメ ン トを含有するプラス ミ ド、 該プラス ミ ドを舍 有する大腸菌及びこの大腸菌を用いるヒ ト ープロゥ ロキナー ゼ様ポリ ぺプチ ドの製造方法、 並びに該ポリ ぺプチ の使用 に関する。 背景技術
    [0003] ヒ ト -ゥロキナーゼは人尿中に微量に存在する酵素であり 不活性のブラ ス ミ ノ一ゲンをプラス ミ ンに活性化する作用を 有し、 生成したプラス ミ ンは血栓を溶解することができる。 このゥロキナーゼはジスルフィ ド結合により連結された 2本 のポリ ペプチ ド鎖からなる。 これに対してヒ ト —プロゥ ロキ ナーゼは前記の 2本のポリ ぺプチ ド鎖がア ミ ド結合によって 連結された一本鎖ポリ べプチ ドであり、 このプロウ πキナー ゼ自体は血液中で前記の活性を有しないが、 1個のア ミ ド結 合が切断される こ とにより、 活性を有する前記のゥロキナー ゼに転換される。
    [0004] 特願昭 61 - 12984 (特開昭 62— 143686) (ΕΡ 0 210 279 ) には 135位のァ ミ ノ酸及び 157位のア ミ ノ酸を変化せしめた安定 化されたヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドが開示され ている。 しかしながら、 これらは、 135位と 136位のア ミノ 酸の間の切断、 及び/又は 158位と 159位のア ミノ酸の間の 切断を抑制しょう とするものであり、 本発明のポリ ぺプチ ド とは全く異る。
    [0005] EP 0200451に記載されているプロウロキナ -ゼ及び特願昭 61 - 12984 (特開昭 62— 143686) (EP 0 210 279) に記載されて いるプロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドはいずれも、 血栓以外 の部位で事実上活性を有しないため、 大量に投与する場合で も全身性出血等の副作用が回避されると想定されている。 し かしながら他方、 血栓部位における二本鎖への変換速度が遅 いと思われる。
    [0006] ヒ ト —ゥ口キナーゼは前述のように活性化酵素であるため- 血液中に大量に含まれている種々の阻害物質により速やかに その活性を失う。 従って治療薬として用いられる場合は、 大 量投与の必要がある。 その結果、 副作用として全身的にブラ ス ミ ンが生成して、 全身性の出血傾商を招きやすい。
    [0007] プロウロキナーゼは一本鑌ゥ口キナーゼとも称され血漿 φ では通常活性を有しないが、 血栓の存在部位においてはプラ ス ミ ノ ーゲンをプラス ミ ンに変換する弱い活性を有する。 組 織プラス ミノ一ゲンァクチベータ一またはブロウ口キナーゼ の作用により生成する少量のプラスミ ンは、 プロゥロキナー ゼを高活性のニ本鎮高分子ゥ 口キナーゼに変換するためブラ ス ミノ ーゲンからプラスミ ンへの変換が急速に進み、 血栓が 溶解するものと考えられる （文献 1 ) 。 プロゥロキナーゼを血栓溶解剤として用いる場合、 少量の 投与では十分量のブラス ミ ンが生成せず、 血栓を効果的に溶 解させることはできない。 一方必要以上に投与する場合には たとえ一時に大量のプラス ミ ンが生成しても、 血栓部位から 離れて血栓溶解に参加しないものが増えるため、 血栓溶解の 効率は上がらない。 又そのようなプラス ミ ンは、 一部は o 2— アンチプラス ミ ン等の阻害剤によつて失活し、 他は血栓以外 の部位でプロゥロキナーゼの活性化を引き起こすため全身性 出血等の副作用の原因となる。 従ってプロウ 口キナーゼの投 与においては必要以上のブラスミ ンが一時に生成しないよう な投与量及び投与法が望まれる。 またプロゥロキナーゼは ト ロ ンビンによつて Arg l 56と Phe l57の間のぺプチ ド結合を切断 されると、 もはやプラス ミ ンによる賦活化をう けないことが 報告されている （文献 2 ) 。 従って ト ロ ンビンの存在下では プロゥロキナーゼは千分にその機能を発揮できない。
    [0008] EP 0200451には第 136〜 138 位のア ミ ノ酸を変化させたプ 口テア—ゼ抵抗性ゥロキナーゼが記載されている。 しかしな がら、 このゥロキナーゼはすべて、 プロゥ ロキナーゼの活性 化のために 158位のア ミノ酸と 159位のア ミノ酸との間の切 断を必要とし 、 想定のもとにこの部位のプ口テア—ゼ による切断を完全に防止することが意図されており、 本発明 のポリ ペプチ ドとは全く異る。
    [0009] 従って、 血栓特異性が高いという ヒ ト ープロゥロキナーゼ の性質を維 しつつ、 大量投与においても副作用を示さず、 かつ血栓生成 ©途上 ¾び終了後において速やかに活性化され、 そしてそれ故に前記のごとき ヒ ト ーゥ πキナーゼ、 ヒ ト ープ ロウ口キナーゼおよび前記の誘導体が有する諸欠点を有しな い新しいヒ ト ープロゥロキナーゼが求められる。 しかしなが らそのようなヒ トープロウ口キナーゼは知られていない。 発明の蘭示
    [0010] 従ってこの発明は、 生体内に投与された場合に天然型のヒ トープロゥロキナーゼより も、 血栓に対して特異性が高く、 大量投与時にも副作用を示さず、 且つ ト ロ ンビンによっても 活性化され、 改良された速効性を有し、 さらに好ましく は
    [0011] 156位のァ ミ ノ酸と 157位のア ミノ酸との間の ト ロ ンビン切 断による不活性化を受けにく いヒ ト -プロウ口キナーゼ様ボ リ ぺプチ ド、 該ポリぺプチ ドを製造するための遣伝子系及び この遺伝子系を用いる該ポリ ベプチ ドの製造方法、 並びに該 ポリ ペプチ ドの使用を提供するものである。
    [0012] さらに詳し く は、 発明は、 次の式：
    [0013] (Me t) ' Ser 1 - X 1 5 6 · Υ 1 5 7 · Ζ 1 5 8 -
    [0014] (式中、 Me tは場合によつては存在するメ チォニンであり Ser は N未潢の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニ ン又は他のア ミノ酸であり、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グリ シ ン、 ァラニ ン又はバリ ンであり、 Zは 158位に存在する リ ジ ン又はアルギニ ンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト―プロウ口キナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ァ ミノ酸以外のア ミノ酸に変更されたヒ ト -プロ ゥ ロキナ一ゼ様ポリ ぺプチ ドの、 ァ ミ ノ酸配列の対応する部 分と同一のァ ミノ酸配列である。 ）
    [0015] で表されるァ ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のア ミノ酸 配列を有するヒ ト ープロゥロキナ一ゼ様ポリ ぺプチ ドを提供 する。
    [0016] この発明はさらに、 前記ヒ トープロゥロキナーゼ様ポリ べ プチ ドをコー ドする D N Aセグメ ン トを提供する。
    [0017] この発明はさらに、 前記 D N Aセグメ ン ト、 その発現のた めの制御領域及び大腸菌中で複製するのに必要な D N A配列 を含有するプラス ミ ドを提供する。
    [0018] この発明はさ らに、 前記プラス ミ ドにより形質転換された 大腸菌を提供する。
    [0019] この発明はさらに、 前記形質転換された大腸菌を培養し、 その培養液から前記ポリ ペプチ ドを採取することを特徴とす る ヒ ト -プロウ口キナーゼ様ポリ ペプチ ドの製造方法を提供 する。
    [0020] この発明はさ らに、 前記ヒ ト ―プロウ口キナーゼ様ポリ べ プチ ドを医薬賦形剤と共に含んでなる医薬を提供する。
    [0021] この発明はさ らに、 血牷の溶解剤の製造のための前記ヒ ト ープロウ口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドの使用を提供する。
    [0022] この発明はさ らに、 前記ヒ ト ―プロウ 口キナーゼを患者に 投与することを特徴とする血栓形成に対する予防又は治療方 法を提供する。
    [0023] 本発明の速効性を有するヒ ト ープロゥ ロキナーゼは、 ブラ ス ミ ンによって活性化されるのみならず、 天然型のヒ ト ープ ロウ ロキナ一-ゼにない性質として、 血栓生成時にのみ出現す る トロンビンによっても速やかに活性化される。 このためこ れらがヒ トに投与された場合、 活性の発現が従来のヒ トープ ロウ口キナーゼよりも血栓の存在部位に限定されるうえ、 血 栓生成の初期に速やかに行なわれることになり、 全身性出血 傾向等の副作用の少ない、 速効性の血栓治療薬として期待さ れる。
    [0024] 他方、 本究明のヒ トープロゥロキナーゼ様ポリペプチ ドを コ ー ドする D N Aセグメ ン トを舍有する遺伝子系を用いる場 合、 該ポリ ぺプチ ドが効率よ く発現され、 従って、 該ポリ ぺ プチ ドが経済的に有利に製造される。 図面の簡単な説明
    [0025] 第 1 一 1図〜第 1 〜 4図は天然ヒ ト ―プロウ口キナーゼを — ドする c D N Aの塩基配列及び対応するア ミノ酸配列を 示す。
    [0026] 第 2 - 1図及び第 2 - 2図は出発プラスミ ド 及び pMUP lpm からの Φ間体プラスミ ド の作製を示す。
    [0027] 第 3図はプラスミ ド ΡΜϋΤ9 &からプラス ミ ド p I Q - Δの作製を 示す o
    [0028] " 第 4 一 1図は、 本発明のヒ ト —プロゥロキナーゼ様ポリ ぺ プチ ド中の 156位、 157位及び 158位の変異ア ミノ酸を含む 部分をコー ドする合成 D N Aオ リ ゴマーの塩基配列及び対応 するア ミノ酸配列を示す。
    [0029] 第 4 - 2図及び第 4 一 3図は、 第 4 一 1図と同様のその他 の合成 D N Aオ リ ゴマーの塩基配列及び対応するァ ミノ酸配 列を示す。
    [0030] 第 5図はプラス ミ ド PMUT9Q-RPKの作製の過程を示す。
    [0031] 第 6図はプラ ス ミ ド pM(JT9Q-UPI5の作製の過程を示す。
    [0032] 第 7図はプラ ス ミ ド PMUT9Q-&PRの作製の過程を示す。
    [0033] 第 8図はプラス ミ ド PMUT9Q.-SGRの作製の過程を示す。
    [0034] 第 9図は、 本発明の変異型プロウ口キナーゼ Q-RPK及び
    [0035] Q-RPR の精製標品の S D S —ポリ アク リ ルア ミ ドゲル電気泳 動のパター ンを示す。
    [0036] 第 1 0図〜第 1 1図は、 本発明の変異型プロウ口キナーゼ Q- RPK及び Q- RPRの精製標品の、 プラス ミ ン又は ト ロ ンビン による活性化の経時変化を示す。
    [0037] 第 1 2図は、 本発明の変異型プロウ口キナーゼ Q- RPK及び Q-RPKの精製標品の、 ト ロ ンビ ン処理後の残存活性を、 ト ロ ンビ ン処理時間に対してブロ ッ ト したものである。
    [0038] なお、 第 9図〜第 1 2図において、 対照標品と して天然型 プロゥロキナーゼ並びに変異型プロウ口キナーゼ Q (135) D (157)を用いた結果も併せて示す。
    [0039] 発明を実施するための最良の形態
    [0040] A . 速効性を有するヒ ト —プロゥロキナーゼ様ポリ べプチ
    [0041] K
    [0042] この発明の速効性を有する ヒ ト ープロゥ ロキナーゼ様ポリ ペプチ ドは、 次の式 ：
    [0043] (Met) · Ser1 - X1 56 · Y1 57 · Ζ1 58—
    [0044] (式中、 Me Uま場合によっては存在するメ チォニ ンであり Ser は N未潢の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニン又は他のア ミノ酸であり、 Yは 157位に 存在するプ π リ ン、 グリ シン、 ァラニン又はバリ ンであり、 Zは 158位に存在するリ ジン又はアルギニンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト—プロゥロキナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ァ ミノ酸以外のアミノ酸に変更されたヒ トープロ ゥロキナ一ゼ様ボリ ぺプチ ドの、 ァ ミノ酸配列の対応する部 分と同一のァ ミノ酸配列である。 ）
    [0045] で袠されるァ ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミノ酸 配列を有する。
    [0046] ヒ トープロゥロキナーゼは 411俪のア ミノ酸から成る 本 鎖のポリペプチ ドであり、 そのア ミノ酸配列は既に知られて いる （文献 3 ) 。 ヒ ト—プロゥロキナーゼのプラス ノ ーゲ ンァクチベータ一活性は低く、 生体内においては通常プラス ミ ンによって 158位リ ジンと 159位イ ソロイ シンの間のぺプ チ ド結合が切断されて、 活性が発現されるものと考えられて いる （文献 3 ) 。 正常な生体内においては、 プラス ミ ンは不 活性な前駆体であるプラスミノ ーゲンとして存在している。 ところがなんらかの病的な原因により一度血栓が形成される と、 それが刺激となって- から分铋される組織プラス ミノ一ゲンァクチべ一ターにより血管表面においてプラス ミ ンが生成し、 それによつて血栓溶解が開始されるものと考え られる （文献 1 ) 。 従ってプ πゥ αキナ一ゼを生体内に投与 した場合、 その活性の発現はプラス ミ ンの存在部位、 換言す れば血栓表面に限定されるため、 ヒ ト —ゥ ロキナーゼを投与 した場合に見られるような全身性の出血傾向が回避される と 考えられる。 しかしながら、 プロゥロキナーゼを血栓溶解剤 として用いる場合、 少量の投与では十分量のプラス ミ ンが生 成せず、 血栓を効果的に溶解させることはできない。 一方必 要以上に投与する場合はたとえ一時に大量のブラス ミ ンが生 成しても、 血栓部位から離れて血栓溶解に参加しないものが 増えるため、 血栓溶解の効率は上がらない。 又そのようなプ ラス ミ ンは、 一部は α 2—アンチプラス ミ ン等の阻害剤によつ て失活し、 他は血栓以外の部位でプロウ 口キナーゼの活性化 を引き起こすため全身性出血等の副作用の原因となる。 さ ら に血栓上に残存している凝固系酵素 ト 口 ンビンは、 プロウ 口 キナーゼの 156位アルギニンと 157位フエ二ルァラニンとの 間のぺプチ ド結合を切断し、 プラス ミ ンによるプロゥロキナ ーゼの活性化を不可能にする こ とが知られている （文献 2 ) c ト ロ ンビンは血液凝固カスケー ド機構の最終段階でフ ィ ブ リ ノ 一ゲンをフ イ ブリ ンモノ マーに変換する。 フ イ ブリ ンモ ノ マ—は自己会合により巨大なフィ プリ ンネ ッ トワークを形 成し、 血栓となる。 一方 トロ ンビ ンはその過程で一部がフ ィ プリ ンネ ッ トワークに捕束されるが、 他は血栓表面に放出さ れてネ ッ トワークを拡大する。
    [0047] 血栓の形成後は、 捕束を免れた ト ロ ンビンはア ンチ ト ロ ン ビ ン 1等により速やかにその活性を失う力;、 捕束された ト ロ ンビンは活性を維持しつつ拡散によつて血栓表面に出現する (文献 4 , 5 ) 。 捕束された ト ロ ンビンはまた、 線溶系酵素 によつて血栓が溶解された時点で血流中に放出されるので (文献 4〉 血栓の再形成の原因となり得る。
    [0048] 本発明者等は、 プロゥロキナーゼの 157位フユ二ルァラ二 ンをプロリ ンに換えることにより、
    [0049] i ) 天然型のプロウ口キナーゼより もプラスミ ンによる活 性化速度が小さ く ； そして
    [0050] ϋ ) 天然型のプロゥロキナーゼと異なり トロンビンによつ て陚活化される ；
    [0051] という性質を有する全く新し 1い oプロゥロキナーゼを創出した < i ) の性質により本発明のプロゥ πキナーゼは大量投与にお いても全身性出血等の副作用を示さないと思われる。 また前 記の ト ロ ンビンの局在性を考慮すると、 H ) の性質により血 拴の生成初期から終了後までにわたつて血栓部位特異的にか つ速やかに活性を発現するのみならず、 血栓溶解後に放出さ れる ト ロ ンビンによる血栓の再形成の際にも、 効果的な溶解 作用を発攆することが期待される。
    [0052] さて、 本発明者等により初めて見出されたプロウ口キナー ゼに関する上記の事実は、 ト 口 ンビンの基質特異性によって 合理的に説明される （文献 6 ) 。 すなわち、
    [0053] - I
    [0054] - P z - P i - P i ' -
    [0055] ( P Z , P 1 及び P ! ' は任意のァ ミノ酸を表す。 i印は ト ロ ンビンによる切断部位を表す。 ) のごときア ミノ酸配列に おいて、 P！ がリ ジン又はアルギニンであり、 F z がプロ リ ン、 グリ シン、 ァラニン又はバリ ンである場合、 ト ロ ンビン は P i と ' の間のペプチ ド結合をよ く分解する。 但し上 記の組合せの場合、 P , ' がプ π リ ンである場合は全く分解 しない。 従って 157位がフヱニルァラニンである天然型プロ ゥロキナーゼと、 157位がプロ リ ンに置き換えられたプロウ 口キナーゼの、 それぞれの ト ロ ンビンに対する挙動は次のよ う にまとめられる ：
    [0056] Ϊ ト ロ ンビン
    [0057] - P 2 - P i - P 1 ' によ る切断
    [0058] 天然型 Pro155-ArgJ 56-Phe' 5 有 （ ト ロ ンビ ンに (Phe157) よる不活性化）
    [0059] PheI 5 -Lys158-lle159 本発明 -Pro 1 S3-Arg 156-Pro' 57
    [0060] (Pro157)
    [0061] -Pro, 57-Lys, 58-lle159 ( ト ロ ンビ ン よる活性化） すなわち、— —型プロゥロキナ —ゼにおいて、 まず 155位 プロ リ ン、 156位アルギニ ン及び 157位フエ二ルァ ラ ニ ンの 配列においては、 156位ァルギ二 ン と 157位フ エ 二ルァ ラ 二 ンの間のぺプチ ド結合が ト ロ ンビ ンによって切断されやすく これにより天然型プ πゥロキナーゼは不活性化されるが、 157 位フ ヱニルァ ラ ニ ン、 158位リ ジン及び 159位イ ソロイ シ ンの配列においては、 158位リ ジ ン と 159位ィ ソ ロ イ シ ン の間のぺプチ ド結合は ト ロ ンビ ンによつて切断されに く く 、 従って天然型プロゥ ロキナーゼの ト 口 ンビンによ る活性化は 起こ らない。 一方、 本発明のプロゥロキナーゼ（157位プ口 リ ン） において、 まず 155位プ口 リ ン、 156位アルギニ ン及び 157 位プロ リ ンの配列においては、 156位ァルギニ ン と 157 位プロ リ ンの間のべプチ ド結合は ト ロ ンビンによって全く切 断されず、 従ってプロゥロキナーゼの不活性化は起こらない が、 157位プ口 リ ン、 158位リ ジン及び 159位ィ ソ ロイ シン の配列においては、 158位リ ジンと 159位イ ソロイ シンの間 のべプチ ド結合がトロ ンビンによつて切断されやすく、 これ により本発明のプロゥロキナーゼは活性化される。
    [0062] また、 本発明の 157位をプロリ ンに置き換えたプロゥロキ ナ一ゼが、 プラスミ ンによっても活性化された事実は、 本来 この部位はプラスミ ンの切断部位であるために、 立体構造的 にもプラスミ ンが作用しゃすいため、 157位のア ミノ酸の置 換によっては、 プラスミ ンの切断作用に大きな影響を与えな いと考えることにより説明することができる。
    [0063] 本発明においては、 前記の ト口ンビンの基質特異性を考慮 して、 前記の X , Υ及び Ζの組合せの具体例として次のよう なポリ ペプチ ドを諷製した。
    [0064] 記号 '— Χ Υ Ζ
    [0065] (1 ) RPK Arg Pro Lys
    [0066] (2) RP R ftrg Pro Arg
    [0067] (3) QPR G i n Pro Arg
    [0068] (4) SGR Ser G l y Arg
    [0069] 上記の各種ポリ ペプチ ドを後で詳細に記載するように、 そ れらの活性化に及ぼすプラス ミ ン及び ト 口 ンビンの効果によ り調べた。 その結果、 前記の 4種類の置換の組合せは、 いず れも目的とする性質即ちプラス ミ ン及び ト ロ ンビンによって 活性化される性質、 並びに ト口 ンビンによつて不活性化され ない性質を、 新たにプロゥロキナーゼに与えることが確認さ れた。 さ らに、 上記の各種ポリ ペプチ ドを後で詳細に記載す るように、 それらによるフィ プリ ン塊の溶解時間に及ぼす ト ロ ンビンの効果により調べた。 その結果、 前記の 4種類の置 換の組合せはいずれも、 目的とする性質、 即ち ト ロ ンビン濃 度が高いほど速やかにフィ プリ ン塊を溶解させる性質を、 新 たにプロゥロキナーゼに与えることが確認された。 従ってこ れらの事実は、 前に定義した X , Y及び Zのすベての組合せ からなるポリ ペプチ ドは、 プラス ミ ン及び ト ロ ンビンによつ て活性化される性質、 ト ロ ンビ ンによって不活性化されない 性質、 並びに ト ロ ビン濃度が高い程速やかにフ イブリ ン塊 を溶解せ る性寳をプ口ゥロキナーゼに与えるものと合理 的に推定される。 従って、 前に定義した X , Υ及び Ζの組合 せからなるプロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドは全て本発明の 範囲に属する。
    [0070] この様な本発明のポリ ペプチ ドにおける X , Υ及び Ζの組 合わせとして、 例えば前記の組合わせ（1) R Ρ Κ、 （2) R P R、 ） Q P R、 及び (4) S G Rのほかに、 次の様な組み合わせを用 いることができる。
    [0071] (5) X-Gly-Lys (TUK-XGK)
    [0072] (6) X-Ala-Lys (TUK-XAK)
    [0073] (7) X-Ala-Arg (TUK-XAR)
    [0074] (8) X-Val-Lys (TUK-XVK)
    [0075] (9) X-Val-Arg (TU -XV )
    [0076] 上記の配列の内 Xは天然ポリ ぺプチ ド中に存在する A r g 又はその他の任意のア ミ ノ酸を意味する。 前記一般式中の実線で示されるァミノ酸配列は、 天然型ヒ ト ープロゥロキナーゼ又は 135位のリ ジンが塩基性ァ ミノ酸 以外のァ ミノ酸に変更されたヒ トープロゥロキナ一ゼ様ポリ ペプチ ドの、 ァ ミノ酸配列の対応する部分と同一である。 天 然型ヒ トープロゥロキナーゼのァ ミノ酸配列として、 ヒ ト腎 臓由来の m R N Aに対応する c D N Aにより コー ドされてい る、 アミノ酸 411個からなる配列を挙げることができる。 こ のア ミノ酸配列は第 1 一 1図〜第 1 〜 3図に、 アルフ ァ べ ッ トの大文字 3文字からなるア ミノ酸記号により示されている。
    [0077] 135 位のリ ジンが塩基性ァ ミノ酸以外のァミノ酸に変更さ れたヒ ト―プロウロキナ一ゼ様ポリ ぺプチ ドは特願昭 61 - 12984
    [0078] (特開昭 62— U3686) (EP 0 210 279) に詳細に記載されてい る。 135位における塩基性ァミノ酸以外のアミノ酸としては、 例えばァラニン、 ァスパラギ ン、 ァスパラギ ン酸、 グルタ ミ ン、 グルタ ミ ン酸、 フエ二ルァ ラ ニ ン、 グリ シン、 イ ソロイ シ ン、 ロ イ シ ン、 メ チォニン、 セ リ ン、 ス レオニン、 ノヾリ ン、 ト リ プ トフ ァ ン、 チロ シ ン、 プロリ ン等を挙げることができ る。
    [0079] 前記一般式中、 （Me t)は、 プロゥロキナーゼの N末端の 1 位の Serに隣接してその N末端側に存在する場合があるメ チ ォニ ンを示す。
    [0080] 本発明の速効性を有するヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ ぺ プチ ドは、 上に詳細に記載したァミノ酸配列を有するポリ ぺ プチ ドの他に、 これと実質上同じ配列を有するポリ ぺプチ ド を包含する。 ここで、 実質上同じアミノ酸配列とは、 上記の ア ミノ酸配列中の X , Y及び Z以外の少数個のア ミノ酸が他 のア ミノ酸によって置き換えられており、 又は除去されてお り、 あるいは上記のァ ミノ酸配列に少数個のァ ミ ノ酸が付加 されているが、 しかしなぉプロウ口キナーゼの生理的性質及 び本発明の特徴であるプラス ミ ン及び ト ロ ンビ ンによって容 易に活性化されるァ ミノ酸配列を意味する。 特定の生理活性 を有するポリ ぺプチ ド中の該生理活性に関与しない領域にお いてア ミノ酸配列に変更を加えても、 該生理活性が影響を受 けない場合があることは、 当業者により良く知られている。 挺って、 そのような変更を含むポリ ペプチ ドも、 本発明の特 徴を有している限り本発明の範囲に属するものである。
    [0081] B . ヒ ト -プロゥロキナーゼの遺伝子系及び製造方法 この発明ばさ らに、 速効性を有するヒ ト ープロゥロキナー ゼを製造するために有用な遺伝子系及びその遺伝子系を用い たヒ ト —プロゥ ロキナーゼの製造方法に関する。 こ こ で遺伝 子系とは、 目的とするヒ ト ―プロウ口キナーゼ様ボリ べプチ ドをコ一 ドする D N Aセグメ ン ト、 この D N Aセグメ ン トを 含有する発現型プラ ス ミ ド、 及びこの発現型プラス ミ ドが導 入された宿主を包含する。
    [0082] 本発明の速効性を有する.ヒ ト ―プロウ口キナーゼをコー ド する D N Aセグメ ン トは、 天然のヒ ト ―プロウ口キナーゼを コ ー ドする D N A、 又は特願昭 61 - 12984 ( E P 0 21 0 279)に記 載の安定化されたヒ ト - プロウ 口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドを コー ドする D N Aから誘導される。 すなわち、 それらの D N Aにおいて、 ターゲッ トのア ミノ酸 _ (前記 X , Y及び Z ) の 位置に対応するアミノ酸をコー ドするコ ドンを変異させて、 変換すべきァミノ酸をコー ドするコ ドンに転換する。 変異の 導入方法は、 タ一ゲッ トのアミノ酸をコー ドするコ ドンを舍 む D N A断片を、 ターゲッ トのア ミノ酸をコー ドするコ ドン が目的のアミノ酸をコー ドするコ ドンに変更された合成 D N A断片に置き換えることによって行なう。 置き換えられ る D N A断片は適当な制限酵素の作用によって生成する比較 的小さなものが好ましい。 合成 D N A断片においてタ一ゲッ トのア ミノ酸及びそれ以外のア ミノ酸をコー ドするコ ドンと して、 全ての縮重したコ ドンを用いることができるが、 望ま し く は宿主内で容易に発現され得るコ ドンを用いるとともに それらコ ドンの連続によつて m R N Aレベルの折り畳構造を 形成しないように留意すべきである。 又よ く知られた M 13フ ァ一ジを用いる方法で変異を導入することもできる。
    [0083] なお、 本発明の具体例においては、 プロゥロキナーゼをコ ー ドする遺伝子源として、 プラス ミ ド PMUT4L及びプラスミ ド pMUP lpm を使用する。 これらのプラス ミ ドの作製方法及び特 性は特願昭 61 - 12984 (特開昭 62— 143686) (EP 0 210 279) に 詳細に記載されている。 プラス ミ ド pMUT4Lは天然プ口—ゥ口 キナーゼのァ ミノ酸をコ一ドする D N A断片を舍有するが、 癸現効率を改善するため、 その N -末端コー ド領域として、 天然 c D N A中のコ ドンの代りに次のコ ドンが使用されてい る。 Me t Ser Asn G l u し su H i s G i n Va l Pro Ser
    [0084] 5 ' ATG AGC AAC GAG CTC CAC CAG GTT CCG TCG 3 ' 3 ' TAC TCG TTG CTC GAG GTG GTC CA A GGC AGC 5 ' なお、 PMCT4Lの作製方法を参考例 1及び 2 に示す。
    [0085] 本発明の速効性を有するヒ ト ープロゥロキナーゼをコ ー ド する D N Aセグメ ン トは、 発現型プラス ミ ドに組換えられる。 その発現型プラス ミ ドを宿主細胞に導入することによって目 的のヒ トープロゥロキナーゼが、 宿主細胞又は培養液中に蓄 積する。 特願昭 61 - 12984 (特開昭 62 - 143686) (EP 0 210 279) に記載のヒ ト ープロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドを製造する 方法は、 全て本発明の速効性を有するヒ ト -プロウ口キナー ゼの製造に適用できる。 それらの具体的な詳細は本明細書の 実施例に記載されているが、 実施例以外の宿主並びに発現べ クタ一を用いることも本発明の範囲に属するものである。
    [0086] 宿主細胞として大腸菌を用いる場合、 生産されるプロゥ ロ キナーゼ様ポリ ベプチ ドは超音波又はゴーリ ンホモジナイ ザ —等による菌体破砕後に、 通常不溶性の凝集物として回収さ れる。 この.凝集物を、 4 M塩酸グァニジン溶液中で溶解させ、 しかる後に塩酸グァニジン存在下で空気酸化ないしはチォ— ル化合物と反応させ„るこ とによ って、 目的物の立体構造を再 現させる。 ついで硫安等による塩折により 目的物を回収した のち、 塩酸グァニジン存在下で疎水的相互作用を利用したク ロマ トグラフ ィ —及び金属イ オ ンとの相互作用を利用したク ロマ トグラフ ィ 一によつて精製されるが、 これら以外の通常 用いられる'生化学的分離技術を用いることもできる。 本発明のヒ トープロゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドは血栓の 形成等に対する予防薬又は治療薬、 特にそれらに対する治療 薬として有用である。 このために主として非経口投与により - 例えば静脈内投与、 腹腔内投与、 皮下投与、 筋肉内投与等に より投与される。 投与量は患者の状態、 投与方法等により異 る。 非経口投与用医薬は通常常用の注射用賦形剤中の溶液と して、 あるいはこれらの溶液からの凍結乾燥製剤として用い られる。 1
    [0087] 8
    [0088] 次に実施例及び参考例により この発明をさらに具体的に説 明する。 但し、 この発明がこれらの実施例により限定される ものではない。
    [0089] なお、 実施例における反応条件は次の通りである。
    [0090] 各制限酵素の反応
    [0091] D M A (プラスミ ド又は D N Aフラグメ ン ト） 1 を含む 下記の各反応溶液 5 0 /^に、 1 0ユニッ トの各制限酵素を加 えて、 下記の各温度で 2待閩保温した。 また、 部分消化を行 う場合は、 加える制限酵素の量を 1〜 2ュニッ ト とし、 保温 時間を 0. 5〜 1時間とした。
    [0092] 制限酵素 K 液の & &応温度
    [0093] Aa t I l OmMト リ ス塩酸 （pH 7* 5 ) 、 37で
    [0094] 50mMKC &、 l OmM MgC ί z 、
    [0095] 1 πιΜジチオスレィ トール
    [0096] BamH I 6 ト リ ス塩酸 （pH 7. 9 ) 、 30で
    [0097] 150mMN aC £、 6 mM M gC ί 2
    [0098] Ban 2
    [0099] ί 6 mMト リ ス塩酸 （pH 7. 4 ) 、 37 'c
    [0100] 50mM NaC £ . 6 mM MgC & z 、
    [0101] l OmM β ―メ ルカプ トェタノ一ル Dra Π lOraM ト リ ス塩酸 （pH 8. 0 ) 、 37 *C 40mMKC 、 7 mM MgC 、 7 mN
    [0102] ー メ ルカ プ ト エタ ノ ール
    [0103] EcoR I 100mM ト リ ス塩酸 （PH 7. 5 ) 、 37 °c
    [0104] 50mM NaC 5 mM MgC & z
    [0105] Hind I lOmM ト リ ス塩酸 （pH 7. 5 ) 37 *c
    [0106] 60mM NaC Si . 7 mM MgC £
    [0107] Nar I 6 mMト リ ス塩酸 （PH 7. 4 ) 、 37 °c
    [0108] 6 mM MgC £ 2 、 6 mM — メ ル
    [0109] カプ トエタノ ール
    [0110] Pst I lOmM ト リ ス塩酸 （pH 7. 5 ) 、 37 'c
    [0111] lOOmMNaC & 、 lOmM MgC & 2
    [0112] Sea I 6 mMト リ ス塩酸 （pH 7. 4 ) 、 37 V
    [0113] lOOmMNaC &、 6 mM MgC £ z .
    [0114] 1 mMジチオス レィ ト ール
    [0115] Sma I 6 mMト リ ス塩酸 （pH 8. 0 ) 、
    [0116] 20mMKC i、 6 mM MgC 2 、 6 mil 25 °c ーメ ルカプ トエタノ ール
    [0117] T4DNA ポリ メ ラーゼによる D N Aの平滑化反応
    [0118] 直鎖状 D N A 1 〜 2 Affを含む下記の反応液 5 0 に、 0. 5
    [0119] 〜 1 ュニ ッ トの T4.DNAポリ メ ラーゼを加え、 3 7 。cで 1 時間 保温した。
    [0120] 〔反応液 ©組成〕
    [0121] 6 7 mM ト リ ス塩酸 （pH 8. 8 ) 、 6. 7 mM MgC £ z 、 16.6mM (NH4) 2S04 、 1 0 mM 一メ ルカプ トエタノ ール、 6. 7 ェチ レ ンジァ ミ ン西酢酸、 0.0167%牛血清ァルブミ ン、 330 dCTPヽ 330 dATPヽ 330 MdGTP及び 330 dTTPo
    [0122] ク レノ ゥフラグメ ン トによる D N Aの平滑化反応
    [0123] 直鎖状 D N A 1 〜 2 を含む下記の反応液 5 0 に、 0. 5 〜 1 ユニ ッ トのク レノ ウフラグメ ン トを加え、 2 5 でで 1 時 簡保温した。
    [0124] 〔反応液の組成〕
    [0125] 6 7 mMリ ン酸カ リ ウム緩衝液 （pH 7. 4 ) 、 6. 7 mM MgC & 2 - 1 mM ーメ ノレカ プ トエタノ ール、 3 3 pMd.4TP、 3 3 i dTTP. 3 3 ^MdGTP. 及び 3 3 pMdCTP0
    [0126] T 4-DN リガーゼによる D N Aの結合反応
    [0127] - 結合させるべき D N Aフ ラグメ ン ト （約 0. 1 ） を舍む 7. 5 の D N A溶液に、 宝酒造㈱製の 「 D N Aライゲーショ ンキ ッ ト」 A液 6 0 W及び同 B液 "L 5 （T*DNAリガーゼを含 む） を混合して、 1 6 でで 3 0分間保温した。
    [0128] 実施例 1. 発現型ブラス ミ ド pMUT9aの作製 （第 2 - 1図及び 第 2 — 2図）
    [0129] 2対の tacプロモーターノオペレーターを有するプロゥロ キナーゼの発現型プラスミ ド pMUT4Lを、 制限酵素 Aat Π及び Sma I により消化し、 電気溶出法により約 5. 5 kbの D N A断 片を単離した。 一方プラスミ ド PMUT4Lを、 制限酵素 Aat Π及 び Sea I により消化し、 電気溶出法により約 6 0 dpの D N A 断片を単離した。 これら 2種類の D N A断片を T4DNAリ ガ一 ゼにより連結し、 大腸菌 103に形質転換した。 形質転換菌 をアルカ リ溶菌法による迅速单離法によって調べ、 1対の tacプロモータ一ノオペレータ一を有するプラス ミ ド pMUT8L を得た。
    [0130] 次いで、 PMUT8Lを制限酵素 Hind ffiによ り消化し、 ク レノ ウ フラグメ ン トを用いて末端を平滑化し、 市販の Pst I リ ンカ 一を連結したのち、 制限酵素 Pst I で消化した。 得られた消 化物より、 3. 3 kbの D N A断片を電気溶出法により単離した 一方、 135位のリ ジンがグルタ ミ ンに変換されたプロゥロキ ナ―ゼ遺伝子及び P Lプロモータ一を有するプラス ミ ド pMUPlpra を制限酵素 Pst I により消化し、 電気溶出法により 1. 2 kbの D N A断片を単離した。 これら 2種類の D N A断片 を、 T4DNAリガ-ゼにより連結し、 tacプ πモータ— /オペ レーターの下流に 135位リ ジンがグルタ ミ ンに変換されたプ ロウ口キナーゼ遺伝子を有する発現型プラス ミ ド PMUT9Lpml を得た。
    [0131] 次いで、 この pMUT9Lpmlを制限酵素 EcoR I により部分消化 し、 ク レノ ウフラグメ ン トにより末端を平滑化したのち、 T4DNA リガーゼにより自己環化を行なった。 得られたク ロー ンより、 プロモータ一ノオペレータ一領域と Sノ D領域との 間に存在する EcoR I サイ トのみが) (mn I サイ トに変換された プラス ミ ドをスク リ ーニングし、 それを pMUT9Xpmlと命名し た。
    [0132] 次いで、 pMUT9Xpmlを制限酵素 BamH I および Nar I により 部分消化し、 ク レノ ウフラグメ ン トにより末端を平滑化しだ のち、 T 4.DNAリガーゼにより 自己環化を行なった。 得られた ク ロー ンより、 プロモーターノオペレーター領域の上流に存 在する BamH I サイ トおよび Nar I サイ 卜の間の約 200bpの D N A断片のみが欠損したプラス ミ ドをスク リ 一ユングし、 それを PMUT9Qと命名した。 pMUT9Qは tacプロモータ— オペ レ一ターの下流に 135位リ ジンがグルタ ミ ンに変換されたプ ロウ口キナーゼ Q ( 135)をコ ー ドする D N A配列を有する発 現型プラ スミ ドである。 なお、 変異型プロウ口キナーゼ Q
    [0133] (135)は、 プラスミ ド pMUPlpmから得られる変異型プロゥロ キナーゼと同一のものである。
    [0134] この実施例において出発材料として使用したプラスミ ド pMUPlpm を舍有する大腸菌ェ ツ セ リ シャ * コ リ （Escherichia coli) は工業技術院微生物工業技術研究所に微ェ研条寄第
    [0135] 969号 （FERM ΒΡ-969)·としてブタぺス ト条約に基き 1985年 1 月 11日に国際寄託されている。
    [0136] なお、 前記のごと く プラス ミ ド 中にコー ドされてい る本発明のヒ ト―プロウ口キナーゼ様ポリ ペプチ ドは 135位 のァミノ酸.としてグルタ ミ ンを有するが、 上記と全く同様に して、 135位のァ ミノ酸としてスレオニンを有するヒ ト―プ ロウロキナ一ゼ様ポリ ぺプチ ドをコ一 ドする D N A断片を舍 有しているプラスミ ド pMUT4Lpm2を前記プラス ミ ド pMUPlpm の代りに使用することにより、 プラス ミ ド PMUT9Qに相当り
    [0137] 135位のァ ミノ酸としてスレオニンをコー ドしているプラス ミ ドを得ることができる。 前記プラス ミ ド pMUT4Lpm2を含有 する大腸菌ェシェ リ シャ · コ リ (Escherichia coli) X 1776 /p UT4L ni2 は微ェ研条寄第 970号 （FERM BP- 970)として - 1985年 4月 18日に鼠際寄託されている。
    [0138] 同様にして、 プラスミ ド pMUPlpmの代りにプラス ミ ド PMUT4Lpm3 を用いることにより、 前記プラス ミ ド pMUT9aに相 当し 135位のア ミノ酸としてリ ジンをコー ドしているプラス ミ ドを得ることができる。 プラス ミ ド pMUT4Lpm3を舍有する 大腸菌ェシェ リ シャ ' コ リ （Escherichia coli) X 1776/ P UT4Lpm3 は微ェ研条寄第 971号 （FERM BP- 971) と して 1985 年 Ί月 11日に国際寄託されている。
    [0139] 実施例 2. 変異導入用プラス ミ ド PIS- Δの作製 （第 3図） 実施例 1 で得られたプラス ミ ド PMUT9Qを制限酵素 Eco47111 によって完全消化したのち、 制限酵素 Pst I によって部分消 化した。 次いで、 T4.DNAポリ メ ラーゼによって末端の平滑化 を行なったのち、 T4.DNAリガーゼによって自己環化を行なつ た。 得られたク ロー ンのう ち、 0.77kbの Eco47111-Pst I 断片 のみを欠損したプラス ミ ドをスク リ ーニングし、 それを plQ - 厶と命名した。
    [0140] 同様にして、 plQ-厶に相当し、 但し 135位のァ ミ ノ酸とし てス レオニン又はリ ジンをコ一 ドしているプラス ミ ドを得る こ ともできる。
    [0141] 実施例 3. Q-RPK 型変異体の作製 （第 5図）
    [0142] 実施例 2 のプラス ミ ド plQ- Δを制限酵素 Dra Π及び EcoR I により消化し、 電気溶出法により 3. 5 kbの D N A断片を単離 した。 一方フォスフア イ ト法によって合成した 2つのオ リ ゴ マ ー 、 ΤϋΚ- RPK(A)及び TUK-RPK(B) (第 4 — 1図） をァニ ー リ ングし、 T 4-DNAリガ一ゼにより 3. 5 kbの D N A断片と連結し、 中間体プラス ミ ド plQ- RPKを得た。 次いで、 plQ-RPKを制限 酵素 Ban Πにより消化し、 電気溶出法により 0.54kbの D N A 断片を単離した。 一方、 実施例 1 のプラス ミ ド pMUT9Qを制限 酵素 Ban Dにより消化し、 電気溶出法により 3. 8 kbの D N A 断片を単離した。 これら 2種類の D N A断片を T4.DNAリ ガ一 ゼにより連結し、 プラス ミ ド pMUT9Q- RPKを得た。 このブラス ミ ドば、 tacプロモーターノオペレーターの下流に 157位フ ェニルァラニンがプロ リ ンに変換され、 且つ 135位リ ジンが グルタ ミ ンに変換された変異型ヒ ト—プロゥロキナーゼ a- BPK をコ— ドする D N A配列を有する発現型プラスミ ドである。
    [0143] このプラス ミ ドを舍有する大腸菌ェシヱリ シャ · コ リ
    [0144] (Escherichia coli) JM 103 (pMUT9Q-RP ) ¾DSM 4187として Deutsche Sammulung von Microorganismeniこブタぺス 卜条約 に基き 1987年 7月 22日に国際寄託されている。
    [0145] 実施例 4. B-RPR 型変異体の作製 （第 6図）
    [0146] 実施例 2 のプラス ミ ド plQ- Δを制限酵素 Dra H及び EcoR I
    [0147] ' により消化し、 電気溶出法により 3. 5 kbの D N A断片を単離 した。 一方、 フォスフア イ 'ト法によって合成した 2つのオリ ゴマー、 ΤϋΚ- RPR(A)及び TUK- RPU(B) (第 4 一 1図） をァニー リ ングし、 T*DNAリ ガーゼにより 3. 5 kbの D N A断片と連結 し、 中間体プラスミ ド PIQ- RPRを得た。 次いで、 pia- RPRを 制限酵素 Ban Eにより消化し、 電気溶出法により 0.54kbの D N A断片を単離した。 一方、 実施例 1 のプラス ミ ド を制限酵素 Ban Πにより消化し、 電気溶出法により 3.8 kbの D N A断片を単離した。 これら 2種類の D N A断片を T4DNA リガ一ゼにより連結し、 プラス ミ ド pMUT9a-RPRを得た。 ^ 5~ プラスミ ドは、 tacプロモーター/オペレータ一の下渌に 157位フエ二ルァラニンがプロ リ ンに変換され、 158位リ ジ ンがアルギニンに変換され、 且つ 135位リ ジンがグルタ ミ ン に変換された変異型ヒ ト―プロウ 口キナーゼ a-RPRをコ一 ド する D N A配列を有する発現型ブラス ミ ドである。 このプラス ミ ドを含有する大腸菌ェシヱ リ シャ · コ リ (Escherichia coli) JM 103 (pMUT9Q- RPR) ^DSil 4186と して Deutsche Sammu 1 ung von Microorganismenにブタぺス 卜条約 に基き 1987年 7月 22日に国際寄託されている。
    [0148] 実施例 5. 0-QPR 塑変異体の作製 （第 7図）
    [0149] 実施例 2 のプラス ミ ド plQ- Δを制限酵素 Dra Π及び EcoB I により消化し、 電気溶出法により 3, 5 kbの D N A断片を単離 した。 一方フ ォ スフア イ ト法によって合成した 2 つのオ リ ゴ マ—、 TUK- QPR(A)及び TUK-QPR(B) (第 4 — 1図） をァニーリ ングし、 T4.DNAリ ガーゼにより 3. 5 kbの D N A断片と連結し, 中間体プラス ミ ド plQ-QPRを得た。 次いで、 plQ-QPRを制限 酵素 Ban Πにより消化し、 電気溶出法により 0.54kbの D N A 断片を単離した。 一方、 実施例 1 のプラス ミ ド PMUT9Qを制限 酵素 Ban Πにより消化し、 電気溶出法により 3, 8 kbの D N A 断片を単離した。 これら 2種類の D N A断片を T4DNAリガ一 ゼにより連結し、 プラス ミ ド PMUT9Q- QPRを得た。 このプラス ミ ドは、 tacプロモータ— Zオペレーターの下流に 156位ァ ルギニンがグルタ ミ ンに変換され、 157·位フヱニルァラニ ン がプロ リ ンに変換され、 158位リ ジンがアルギニンに変換さ れ、 且つ 135位リ ジンがグルタ ミ ンに変換された変異系ヒ ト 一プロゥロキナーゼ Q— QPRをコ - ドする D N A配列を有する 発現型ブラス ミ ドである。
    [0150] このプラス ミ ドを舍有する大腸菌エ シュ リ シ ャ . コ リ
    [0151] (Escherichia coli) JM 103 (pMUT9Q- QPR)は DSM 4188と して Deutsche Sammulung von Microorganismenにフ'タへ。'ス 卜条約 に基き 1987年？月 22日に国際寄託されている。
    [0152] 荬施例 6. Q-SGR 塑変異体の作製 （第 8図）
    [0153] 実施例 2 のプラスミ ド pia- Δを制限酵素 Dra Π及び EcoE I により消化し、 電気溶出法により 3. 5 kbの D N A断片を単離 した。 一方フォスフア イ 法によって合成した 2つのオリ ゴ マー、 TUK-SGR(A)及び rUK- SGU(B) (第 4 — 1図） をァニーリ ングし、 T4DNAリ ガーゼにより 3. 5 kbの D N A断片と連結し. 中間体プラス ミ ド plQ- SGBを得た。 次いで、 pl&- SGBを制限 酵素 Ban Eにより消化し、 電気溶出法により 0.54kbの D N A 断片を単離した。 一方、 実施例 1 のプラスミ ド PMUT9&を制限 酵素 Ban Eにより消化し、 電気溶出法により 3. 8 kbの D N A 断片を単離した。 これら 2種類の D N A断片を T4DNAリガ一 ゼにより連結し、 プラス ミ ド pMUT9a-SGRを得た。 このプラス ミ ドは、 tacプロモーターノオペレーターの下流に 156位ァ ルギニンがセリ ンに変換され、 157位フヱニルァラニンがグ リ シンに変換され、 158位リ ジンがアルギ二ンに変化され、 且つ 135位リ ジンがグルタ ミ ンに変換された変異型ヒ トープ ロウ口キナーゼ（Q-SGR) をコ— ドする D N A配列を有する発 現型プラス ミ ドである。
    [0154] このプラスミ ドを兪有する大腸菌ェシ二 リ シャ ' コ リ
    [0155] (Escherichia coli) - J 103 (pMUT9S- SGR) KDSM "89として Deutsche Sammulung von M i croorganisnten こフ タ ぺス 卜条約 に基き 1987年 7月 22日に国際寄託されている。
    [0156] なお、 実施例 3 〜 6 と同様にして、 但し、 これらの例にお いて使用したプラス ミ ド pl&- Δの代りに、 これに相当じ但し 135位のア ミノ酸としてスレオニン又はリ ジンをコ ー ドして いるプラス ミ ドを用いて、 135位のァ ミノ酸がスレオニン又 はリ ジンである本発明のボリぺプチ ドをコ一 ドするプラス ミ ドを得ることができる。
    [0157] また、 実施例 3 〜 6 に記載したのと同様にして、 但し、 例 えば第 4 — 2図に示すような合成オリ ゴマーを用いて、 他の 変異体例えば TUK- XGK , TUK-XAK , TU -XAR , TUK-KV s 及 び ΤϋΚ-XVRを作製することができる。
    [0158] 実施例 7. 大腸菌による変異型プロ—ゥロキナーゼ潰伝子の発 実施例 1 , 3 , 4及び 5 により得たブラス ミ ド PMUT9Q , PMUT9Q- P , PMUT9Q-RPR. 及び pMUT9Q- QPRを大腸菌 JM 103株 に慣用法に従って形質転換し、 得られた形質.転換-菌を 5 の L 一ブロス中で 3 7 °cにて培養し、 600nmにおける吸光度が 約 0. 4 0. D.になったとき、 5 0 /«£の lOOmMィ ソプロ ピルチオ ガラク ト ピラノ シ ド （ I PTG) を添加し、 さ らに 4時間培養を 続け、 各種変異型プロゥロキナーゼ遺伝子を発現せしめた。 実施例 8. 大腸菌からの遺伝子産物の抽出
    [0159] 実施例 Ίで得られた各培養液より、 遠心分離により 7 O. D. ^相当の菌体を回収し、 0. 1 M食塩を含む 5 0 mM ト リ ス塩酸 緩衝液 （PH 8. 0 ) 1. 4 1 ^中において、 600ηηιにおける濁度が 1 O. D.以下になるまで超音波破砕を行なった。 この破砕液 0. 8 を 1 5 Krpmにて 5分間遠心分離し、 上清を捨てた。 そ の沈澱を 4 M塩酸グァ二ジンを含む 5 0 mM ト リ ス塩酸緩衝液 (PH 8. 0 ) に懸濁し、 室温にて 9 0分間放置して沈澱 物を可溶化した。 次いで、 0.27mM還元型ダルタチオン及び 1.33mM EDTA を含む 5 0 m«ト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 0.48 m£を加え、 2 5 でにて 1 5時間放置した。 次いで、 6 0 %飽 和となるように固形硫安を徐々に溶解させ、 目的の遺伝子産 物を塩折させた。 この硫安塩折物に、 0. 5 M食塩を含むト リ ス塩酸緩衝液 （PH 8. 0 ) を一定量加えて遺伝子産物の粗抽出 液とした。
    [0160] 実施例 9. 大腸菌より抽出した遣伝孑産物の性皙 （ 1 )
    [0161] i ) フイ ブリ ン平扳法によるゥロキナーゼ活性の測定
    [0162] 1 %牛フイブリノ 一ゲン、 0。 25 %ァガロース及び 0. 1 M食 塩を舍む 5 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH7. 4 ) に、 最終濃度 1ュニ ッ ト Z miとなるように牛トロンビンを加えて作製したフイブ リ ン平板上に、 の試料 （実施例 6の粗抽出液を適当に 希釈したもの） をスポッ ト し、 3 7 でにて 1 6時間イ ンキュ ベ— ト後の溶解 Rの直径を測定し、 標準ゥロキナーゼ （日本 曹達㈱製） と比較して活性値を決定した。 その結果実施例 8 で得られた粗抽出液のゥ口キナーゼ活性は、 pMUTQ- SPKから の生成物 （Q-RPK)が 370IUZ 、 ρΜϋΤ9&-1 Ρβからの生成物
    [0163] (Q-RPR) ^ 380IU m£、 pMUTQ— &PR力、らの生成物 （Q-QPR)か' 360 IUZmiであった。
    [0164] ϋ ) プラス ミ ンによる変異型プロウ 口キナーゼの活性化
    [0165] 実施例 8で得られた変異型プロウ口キナーゼ a-RPK , a-RPR又は Q- QPR をそれぞれ含む粗抽出液 1 0 に、 0。 1 M 食塩及び 0.01% ト リ ト ン X- 100を舎む 5 0 mHト リ ス塩酸緩衝 液 （PH 8. 0 ) 8 5 を加えた。 次いで、 最終濃度が 0, 1 , 1 . 1 0及び 5 0 ノ miとなるように のヒ ト ープラス ミ ン水 溶液 （比活性 1 5 カゼイ ンユニッ トノ 蛋白） を加え、 3 7 'cにて 1 5分間反応させた。 反応の停止は加えたブラス ミ ン の 5倍量 （重量比） の大豆 ト リ プシンイ ンヒビタ—を舎む 5 の水溶液を加えることによって行なった。
    [0166] iii ) ト ロ ンビンによる変異型プロウ口キナーゼの活性化 実施例 6で得られた変異型プロウ口キナーゼ ，
    [0167] Q-BPR又は Q-QPRをそれぞれ含む粗抽出液 1 に、 0. 1 M 食塩及び 0.01% ト リ ト ン X- 100を含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝 液 （PH 8. 0 ) 8 5 Wを加えた。 次いで、 最終濃度が 0. 1 , 1 及び 1 0 ノ となるよう に 5 の牛— ドロンビン水溶液
    [0168] (比活性 3ュニッ ト / 蛋白） を加え、 3 7 'cにて 1 5分間 反応させた。 反応の停止ば加えた ト ロ ンビンの 2倍量 （活性 比） のヒルジンを含む 5 Wの水溶液を加える こ とによって行 なった。
    [0169] iv) 合成基質 S-2444による活性化された変異型プロゥ ロキナ ーゼの活性測定
    [0170] ϋ ) 及び iii) で得られた反応液 105 に、 0. 2 mM S-2444 (第一化学薬品製） 、 0. 1 M食塩及び 0.01% ト リ ト ン X-100 を舍む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 0. 7 m を加え、
    [0171] 3 7 ΐにて 3 0分間反応を行なつた。 反応の停止は 0. 1 m の 氷酢酸を加えるこ とによ って行なった。 次いで 3 0分間の反 応における 405ηΐϊΐの吸光度の増加を測定し、 標準ゥ ロキナー ゼ （日本曹達㈱製） の値 （ 3 0分間の反応における 405Mの 吸光度の増加が 1 IUあたり 0.0608) より比例計算によりサン プルの活性値を箕出した。 その結果を第 1表に示す。 この結 果より変異型プロウ口キナーゼ a-RPK , Q-RPR及び a-QPRは プラス ミ ンによって活性化される とともに、 ト ロ ンビンによ つても活性化されることが明らかである。 各種変異 ¾gプロゥロキナ一ゼ:の活性化
    [0172] ¾5 ®刑 プラス ミ ン （/ gZm ) 卜 a ンビン （； Z mi ) プ Πゥ ロ
    [0173] キナーゼ 0.1 1 10 50 0.1 1 10
    [0174] (単位 IUZrnf) (単位 ΙϋΖ mi)
    [0175] Q- P 30.5 154 284 315 4.2 28.4 166
    [0176] Q-RPR 15.8 121 272 315 75.8 385 428
    [0177] Q-QPR 24.2 151 305 385 82.1 369 390
    [0178] QC135) 85。7 374 430 412 8.4 4.6 0 実施例 1 0. 大腸菌より抽出した遣伝子産物の性晳 ( 2 )
    [0179] (フィ ブリ ン塊の溶解時間の測定） 氷浴上に置かれた 9 6穴のマイ クロタイタープレー 卜の各 穴に、 1 5 のフイ ブリノ —ゲン及び 0. 1 M食塩を舍む 5 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7, 4 ) を 0. 2 ずつ入れ、 さらに 165IU/ m£の各種変異型プロウ口キナーゼを舍む実施例 6 の 粗抽出液 0.01 m£及び 5 — 2 0ュニ ッ トノ m£の ト ロ ンビン水溶 液 0.03 m£を添加したのち、 6 5 てに加温された 0。 75 %ァガロ ース及び 0. 1 M食塩を含む 5 0 mMリ ン酸緩衝液 （pH 7. 4 ) 0。06 を素早く混合して、 3 7 。cに保温し、 その時刻を 0 タ ィ ムとした。 混合液は直ちに白濁したゲルに変化するが、 時 間とともに透明になる。 ゲルが透明になり始める時間及び完 全に透明になる時間を測定し、 その中間値をフ イ ブリ ン塊の 溶解時間とした。 その結果を第 2表に示した。
    [0180] 第 2 表
    [0181] フ イ ブリ ン ¾_の溶解時間 ト ロ ンビン （ュ 二 'ン ト Z
    [0182] プロゥロキナーゼ
    [0183] 0.5 1.0 2.0
    [0184] (単 位 分）
    [0185] Q-RPK 53 43 37
    [0186] Q-RPR 36 30 24
    [0187] Q-QPR 37 30 25
    [0188] QC135) 54 63 95
    [0189] 天然型 55 65 92 第 2表より、 天然型プロウ口キナーゼおよび変異型プロウ 口キナーゼ Q (135)が ト ロ ンビン濃度の増大に伴って、 フ ィ ブ リ ン塊の溶解に要する時間が長く なるのとは対照的に、 本発 明の変異型プロウ口キナーゼ Q-RPK , Q-RPR及び Q-QPRは、 ト ロ ンビンの存在時に、 速やかにフイ ブリ ン塊を溶解する こ とが明らかである。 C.Y.Liu らは、 血漿中において血栓が形 成される際に出現する ト ロ ンビンの活性が最大 1 5 ユニ ッ ト / ^に達成するとともに、 この値がフ イ ブリ ノ一ゲンが完全 にフ ィ プリ ンに変換された後、 数分間持続する こ とを示した (文献 4 ) 。 この事実より、 本発明のプロゥ ロキナーゼは、 血栓の生成初期においてもよ く 活性化されて、 速やかな血栓 溶解作用を発現する可能性が高いと考えられる。
    [0190] 本発明の変異型ポリペプチ ド a- RPK , -RPR , 及び
    [0191] & - SGRばト ロンビンによる 158位と 159位との間の切断によ り活性化される特徴を有し、 さらに a-RPK , a-RPR及び
    [0192] Q- QPRは トロ ンビンによる 156位と 157位の間の切断による 不活性化を受けないという追加の利点を有する。
    [0193] 実施例 1 1. 変異型プロウ口キナーゼ a—BPKの精製
    [0194] 実施例 3 により得られたプラスミ ド pMUT9Q-IiPKを大腸菌 JM 103株に慣用法に従って形質転換した。 得られた形質転換菌 を 1 )2 の L —ブロス中で 3 7 'Cにて振盪培養し、 600nmにお ける吸光度が約 0. 4になった時、 1 0 の 0. 1 Mイ ソプロピ ル一 ー D —チォガラク トビラノ シ ドを添加し、 さらに 4時 藺培養を続けた。 次いで遠心分離により菌体を回収し、 （L上 M食塩を含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 5 0 中に おいて、 600nmにおける吸光度が 1 0以下になるまで超音波 破砕を行なった。 この破砕液を 1 5 Krpmにて 3 0分間遠心分 離し、 上清を捨てた。 その沈澱を 4 M塩酸グァニジンを含む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) に懸濁し、 室温にて 9 0 分間放置して沈殺物を可溶化した。
    [0195] 次いで、 0.27mM還元型グルタチオ ン及び 1.33ιπΜエチレンジ ァ ミ ン四酢酸を含む 5 0 mMト リス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 1500 を加え、 2 5 てにて 1 5時間放置後、 4 にぉぃて 2 5 % 飽和となるように固形硫酸アンモニゥムを徐々 に溶解させ、 遠心分離によつて不溶物を除去した後、 さ らに固型硫酸ァン モニゥムを加えて 5 0 %飽和とし、 目的の遺伝子産物（£1- RPK) を塩折させた。 遠心分離によりその塩折物を回収し、 7 %飽 和硫酸ァンモニゥム及び 1 M塩酸グァニジンを舍む 5 0 ト リ ス塩酸緩衝液 （PH 8. 0 ) 2 0 m£に溶解させ、 遠心分離によ り不溶物を除去した後、 7 %飽和硫酸アンモニゥム及び 1 M 塩酸グァニジンを含む 5 0 rnM ト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) で 平衡化したフヱニルセファ ロース CL— 4B (フアルマシア社） のカラム （ ø 1. 5 cm X 3 0 cm) にかけた。 カラムを平衡化緩 衝液 200m で洗浄した後、 1 M塩酸グァニジンを舍む 5 0 mM ト リ ス塩酸緩衝液 （PH 8. 0 ) を用いて目的の遺伝子産物 （Q- RPK)をカ ラムから溶出させた。 次いでその溶出液を 0. 5 M食 塩を含む 5一 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) で平衡化した亜 鉛キレー トセファ ロース 6 B (ファノレマシア社） のカ ラム
    [0196] ( ø 1. 0 cm X 3 0 cm) にかけ平衡化緩衝液 150 (^でカ ラムを 洗浄した後、 0. 5 M食塩を含む 5 0 mM酢酸ナ ト リ ゥム緩衝液
    [0197] (PH 5. 4 ) を用いて、 目的の遺伝子産物 （Q-RPK)をカ ラムか ら溶出させた。 溶出液は、 S D S —ポリ アク リ ノレア ミ ドゲル 電気泳動法により、 単一の蛋白質をのみ含むこ とを確認した。 この結果を第 9図に示す。
    [0198] 実施例 1 2. 変異型プロウ口キナーゼ Q-RP1 の精製
    [0199] 実施例 4により得たプラス ミ ド PMUT9Q- RPRを用いて、 実施 例 1 1 と同様にして、 変異型プロウ 口キナーゼ Q-RPRを精製 した。 精製標品は S D S -ポリ ア ク リ ルア ミ ドゲル電気泳動 法により、 単一の蛋白質であるこ とが確認された。 この結果 を第 9図に示す。 荬旆例 1 3. 変墓型プロウ口キナーゼ &_RPK¾び a-RPRの精 製標品の性質
    [0200] ( i ) プラス ミ ンによる経時的活性化
    [0201] 実施例 1 1又は 1 2 により得た変異型プロゥロキナーゼ
    [0202] Q-RPK 又は a- の精製標品 5 IUを含む 0.01% ト リ ト ン
    [0203] X-100 、 5 0 ト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8。 0 ) 9 5 に、 3 x 10— 4 C Uのプラス ミ ン活性を舍む 5 のブラスミ ン水溶液を 加え、 3 7 でにて種々の時間反応させた。 反応の停止は 0. 1 の大豆ト リ プシンィ ンヒビターを舍む 5 の水溶液を加え るこ とによって行なった。 次に、 この反応液 105 に舍まれ る変異型プ πゥロキナ―ゼの活性を （iv ) に記載した方法で 測定した。 なお対照サンプルとして、 天然型プロウ口キチ一 ゼ及び変異型プロウロキナーゼ Q(135)D(157) (特開昭 62— 143686) (BP 0 210 279) の精製標品を用いた。 この結果を第 ' 1 0図に示す。
    [0204] 第 1 0図に示した結果より、 変異型プロウ口キナーゼ a- BPK 及び Q- RPRは、 天然型プロウ口キナーゼ及び変異型プロウ口 ギナ一ゼ a (135) D (157)と同様にプラス ミ ンにより活性化され ることが明らかである。
    [0205] ( ϋ ) ト ロ ンビンによる柽時的活性化
    [0206] 実施例 1 1又は 1 2 により得られた変異型プロゥ 口キナー ゼ Q- Κ又は Q-RPRの精製標品 4 Ιϋを含む 0.01% ト リ ト ン X- 10(3 、 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8, 0 ) 9 5 に、 x 10— 4 N I Hュニッ トの ト ロ ンビン活性を舍む 5 の ト ロ ンビ ン水溶液を加え、 3 7 。cにて種々の時間反応させた。 次に、 この反応液 105 に舍まれる変異型プロウ口キナーゼの活性 を （iv) に記載した方法で測定した。 反応の停止は、 1 X 10-3 N I Hュニ ッ トのヒルジンを含む 5 の水溶液を加えること によって行なった。 なお対照サンプルとして、 天然型プロウ 口キナーゼ及び変異型プロウ口キナーゼ 8 (135) D (157)の精製 標品を用いた。 この結果を第 1 1図に示す。
    [0207] .第 1 1図に示した結果より、 変異型プロウ 口キナーゼ. Q- ΒΡΚ 及び Q-BPRは ト ロ ンビンによつて速やかに活性化されるこ と が明らかである。 この性質は、 天然型プロウ口キナーゼ及び 変異型プロウ 口キナーゼ Q (135) D (157)にはない全く新規な性 質である。 ,
    [0208] (iii ) ト ロ ンビン処理標品の残存活性の顕現
    [0209] 実施例 1 1又は 1 2 により得られた変異型プロウ 口キナー ゼ ' Q- RPK又は Q- RPRの精製標品 4 IUを舍む 0.01% ト リ ト ン X-100 、 5 0 ιιιΜ ト リ ス塩酸緩衝液 （PH 8. 0 ) 8 5 に、 4 x 10 - N I Hュニ ッ ト の ト ロ ンビ ン活性を含む ト ロ ンビ ン水溶 液 5 Wを加え、 .3 7 。cにて種々の時間反応させた後、 1 X 10一 s N I Hュニッ トのヒルジンを含む 5 の水溶液を加えて反応 を停止させた。 次いで、 0.015 C Uのプラス.ミ ン活性を含む 5 のプラス ミ ン水溶液を加えて、 3 7 。Cで 3 0分間反応さ せた後、 5 の大豆 ト リ プシ ンィ ン ヒ ビターを舍む 5 の水 溶液を加えて反応を停止させた。 次に、 この反応液 105 に 含まれる変異型プロウ 口.キナーゼ 0活性を （ ' ) に記載した 方法で測定した。 なお、 対照サンプルと して、 天然型プロウ 口キナー 及び変異型プロウ 口キナーゼ Q (135) D (157)の精製 標品を用いた。 この結果を第 1 2図に示す。
    [0210] 第 1 2図に示した結果より、 変異型プロウ口キナーゼ a-RPK 及び Q- RPRは、 天然型プロウ口キナーゼ及び変異型プロウ口 キナーゼ a (135) D (157)と異なり、 ト ロ ンビンによってほとん ど不活性化されないことが明らかである。
    [0211] (iv) 合成基質 S-2444による活性化された変異型プ πゥロキ ナーゼの活性測定
    [0212] ( i ), ( ii ) 及び （iii) で得られた反応液 105 に、 0. 2 mM S- 244 第一化学薬品製） 、 0 1 M食塩及び 0.01% ト リ ト ン X-IOO^舍む 5 0 mMト リ ス塩酸緩衝液 （pH 8. 0 ) 0. 7 miを 加え 3 7 ' にて 3 0分 fB反応を行なつた後、 直ちに 0· 1 meの 氷酢酸を加えて反応を停止させた。 次いで、 3 0分間の反応 における 405nmの吸光度の増加を測定し、 ゥロキナーゼ標準 品 (日本曹達㈱製） の値 （ 3 0分間の反応における 405nmの 吸光度の增加が 1 Ιϋあたり 0.0608) より、 比例計箕によりサ ンプルの活性値を算岀した。 その結果を第 1 0図、 第 1 1図 及び第 1 2図に示す。 第 1 0図に示した結果より、 変異型プ ロウ口キナーゼ 及び β-RPRは、 天然型プ πゥロキナー ゼ及び変異型プロウ口キナ一ゼ Q (135) D (157)と同様にプラス ミ ンにより活性化されることが明らかである。 また第 1 1図 に示した結果より、 変異型プロウ口キナーゼ a-RPK及び β-RPE は トロ ンビンによつて速やかに活性化される こ とが明らかで ある。 この性質は天然型プロウ口キナーゼ及び変異型プロウ 口キナーゼ& (135) D (157)にはない全く新規な性質である。 ま た、 第 1 2図に示した結果よ ·、 変異型プロウ口キナーゼ Q-BPK及び Q-RPRは、 天然型プロウ口キナーゼ及び変異型プ ロウ 口キナーゼ Q (135) D (157)と異なり、 ト ロ ンビンによって ほとんど不活性化されないことが明らかである。
    [0213] 参考例 1. (出発プラス ミ ドの作製）
    [0214] 天然型ヒ トープロゥロキナーゼをコ— ドする c D N Aを舍 有するプラス ミ ド PKYU22から出発し、 この天然型 c D N Aの 5 ' 端部分の約 3 0 bPの構造を、 プロゥロキナーゼ遺伝子が シユ ー ドモナス由来の C230遺伝子の S D配列のもとで大腸菌 中で効率よ く発現されるように変形した。
    [0215] プラス ミ ド PKYU22を舍有する大腸菌ェシヱ リ シャ ' コ リ
    [0216] (Escherichia coli) X 1766 (pKYU22)' は微ェ研条寄第 968 号 （FERM BP- 968)と して国際寄託されている。
    [0217] 下記の、 2 9塩基、 1 5塩基及び 2 0塩基からなる 3種類 の単鎮 D N Aオリ ゴマ -をホスホ ト リ エステル法により合成' した。
    [0218] 5 ' CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3 '
    [0219] 3 ' TGCAGTACTCGTTGC 5 '
    [0220] 3 ' TCGAGGTGGTCCAAGGCAGC 5 '
    [0221] 次に、 これら 3種類の合成 D N Aオ リ ゴマー 1 ずつを
    [0222] 9 5 。cにて 2分間加熱処理した後、 T 4ポリ ヌク レオチ ドキ ナ一ゼにより 5 ' 端璣酸化し、 セ ップパック （ C 18) カ ラム (Waters製） によ り精製し、 乾燥した後、 2 0 mM Tris-HC & (PH 7. 6 ) 、 1 0 mM MgC z の溶液 5 0 に溶解し、 9 5 °c にて 2分間加熱した後室温まで徐冷し、 1 2 てにて一晩保持 するこ とによ ってァニールし、 下記に示す二重鎮 D N Aを得 た。
    [0223] 5 ' CATGAGCAACGAGCTCCACCAGGTTCCGT 3 '
    [0224] 3 ' TGCAGTACTCGTTGCTCGAGGTGGTCCAAGGCAGC
    [0225] Aatll Sstll BstNI Taql
    [0226] 一方、 プラスミ ド PKYU22の D N A 5 を制限酵素 _ΐ£ΐΠ及 び at Iにより二重消化し、 約 5.7 kbの D N A断片を電気溶 出により回収した。 他方、 同じプラス ミ ド p!Q'U22の D N A 5 を制限酵素 _mi及び により二重消化し、 電気溶出 して約 400bpの D Ν Α断片を得、 さらにこれを制限酵素
    [0227] Tag I で消化して電気溶出することにより約 260bpの D M A 断片を回収した。 これら 2種類の D N A断片はフユノ ールノ ク ロ口ホルム抽出および 2倍量のエタノ ールによる沈澱によ り精製回収した。
    [0228] これら 2種類の D N A断片と、 前記の合成二重鎮 D M Aォ リ ゴマーとを T4DNAリ ガ—ゼにより連結し、 大腸菌 X 1776を 形質転換した。 形質転換体をアル力 リ溶菌法による迅速単離 法により調べ、 変形されたプ αゥロキナーゼ遺伝子を舍有す るプラス ミ ド pKil'dlを有するク ローン、 ェ シェ リ シャ ♦ コ リ (Escherichia coli) X 1776/ ρΚΜϋΙを得た。 このプラ ス ミ ド pKMUlが導入された大腸菌ヱシエリ シャ ' コ リ
    [0229] (Escherichia coli) X 1776/ ρΚΜϋΙは工業技術院微生物ェ 業技術研究所に、 戡ェ研菌寄第 8040号 （FERM Ρ-8040)として 寄託されている。 参考例 2. プロゥロキナーゼの直接発現型プラス ミ ド（pMUT4い の作製
    [0230] 参考例 1 において得られた 5 のプラス ミ ド PKMUIを制限 酵素 Aat H 1 0 ュニ ッ トにより消化し、 子牛消化管ホスファ タ ーゼ （ C I P ) で処理し、 単離した。 他方、 5 のプラス ミ ド PTCMIを制限酵素 Aat E 1 0ュニッ トにより消化し、 電 気溶出法により約 500bpの D N A断片を単離 れら 2 種類の D N A断片はフエノ一ルノク 口口ホルム抽出およびェ タノ一ル沈鏺を繰り返すことによつて精製回収した。
    [0231] 両者を T4.DNAリガーゼにより連結し、 大腸菌 JM 103に形質 転換した。 形質転換体をアル力 リ浴菌法による迅速単離法に よって調べ、 tacプロモーターノオペレータ一及び C230SD配 ' 列がプロゥロキナーゼ遺伝子に対して正方向に入ったプラス ミ ド pilUTlLを有するク ロー ンを得た。
    [0232] 前記のプラス ミ ド pTCMIは、 tacプロモーターノオペレー ター、 IacSD及び C230SD配列から成る発現制御領域、 並びに C 230 構造遺伝子を含有する。 このプラ ス ミ ドが導入された 大腸菌ヱシヱ リ シャ · コ リ （Escherichia col i) JYi 103 / PTCMI は工業技術院微生物工業技術研究所に、 微ェ研条寄第 1990号 （FERM BP- 1990) と して国際寄託されている。
    [0233] プラス ミ ド pMUTILにおいては、 tacプロモータ 一 ォペレ 一ター、 1 acSD及び C230SDからなる発現制御領域の下流の適 切な位置に本発明の変形されたプロゥ.ロキナーゼ遺伝子が揷 入されている。
    [0234] 次にプラ ス ミ ド PKK223-3 5 を制限酵素 H i nd EI 1 0ュニ トで消化し、 子牛消化管ホスファターゼ（P.L.Biochemicals) で処理した。
    [0235] —方、 前記のようにして得た 1 のプラス ミ ド pMUTlLを 4 ュニッ トの制限酵素 Dra I で消化し、 この消化断片と 5 ' 端 麝酸化した Hind fflリ ンカ一 (dCAAGCTTG) 1 とを T4D Aリガ ーゼにより連結し、 次に 1 2ュニッ トの制跟酵素 Hindmで消 ' 化し、 0.15M aC £溶液とし、 等容量のフュノ ールノク口口 ホルムで抽出後、 これに 2倍容量のエタノ ールを加えて
    [0236] D N Aを沈殺せしめ、 16000rPm、 4 でにて沈穀物を集め、 こ れを乾燥した。
    [0237] この pMUTlい消化断片と、 前記の ΡΚΚ223- 3の Hindm消化断片 とを ： DNAリガーゼにより連結し、 大腸菌 JM 103を形質転換 した。 これらの形質転換菌をアル力リ溶菌法による迅速単離 法により調べ、 プラスミ ド pMUT2Lを舍むク ローンェシエ リ シ ャ · コ リ (Escherichia coii) JM 103 /' pMUT2Lを得た。
    [0238] このプラス ミ ドは、 プロゥロキナーゼ遺伝子の上流に前記 の発現制御領域を有すると共に、 下流に PKK223- 3由来の大腸 菌のリ ボゾーム遺伝子の転写'ター ミ ^ータ— （rrnB , T i T 2) を有する。
    [0239] なお、 プラスミ ド ΡΚΚ223-3は Pharmasia P-し Biochemicals から販売されており、 容易に入手することができる。
    [0240] 5 のプラス ミ ド p UT2Lを、 1 0ュニッ トずつの制限酵素 Sph I及び Tthlll I によりより消化し、 フユノ ール/ク ロ 口ホルム抽出後、 エタ ノ ールで沈毂せしめ、 回収した D M A を 0. 1 mMの dC-TP , dCTP , dATP及び TTPの存在下で T 4 ポリ メ ラ―ゼを用いて末端を平滑化し、 T 4.DN'Aリガ—ゼにより再環 化した。 これを大腸菌 JM 103に形質転換し、 5 0 " ^のァ ン シリ ンを舍有する L B寒天培地上にコ πニーを形成せし め、 アルカ リ溶菌法による迅速単離法で調べ、 プラ ス ミ ド PMUT4Lを含むク ロー ンェ シエ リ シ ャ ' コ リ (Escherichia coli) JM 103ZpflUT4Lを得た 6
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    [0244] 5. Kaminski, .e al.； J . B i o 1. Chem .258 , 10530(1983) 。
    [0245] 6. Jui-Yoa Chang ； Eur . J. S i ocheiti . , 217 (1985)。
    [0246] 7. 特願昭 61- :12984 (特開昭 62— 143686) 明細書。
    [0247] 規則 1 3規則の 2 の寄託された微生物への言及
    [0248] 寄託機関 ： 通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所 あて名 ： 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1番 3号
    [0249] 受託番号及び寄託した日付 ：
    [0250] 1. 微ェ研条寄第 1990号 . 昭和 5 9年 8月 1 7 曰
    [0251] (1988年 8月 4 日に微ェ研菌寄第 7779号"" T 管）
    [0252] 2. 微ェ研菌寄第 8040号 昭和 6 0年.1月 1 1 日
    [0253] 3. 微ェ研条寄第 969号 昭和 6 0年 1 月 1 1 日
    [0254] (1986年 1月 22日に微ェ研菌寄.第 8042'号より移管）
    [0255] 4. 微ェ研条寄第 970号 昭和 6 0年 4月 1 8 日
    [0256] (1986年 1 月 22日に微ェ研菌寄第 8188号より移管） 5. 微ェ研条寄第 971号 昭和 6 0年 7月 1 1 曰
    [0257] (1986年 1月 22日に微ェ研菌寄第 8341号より移管） •^rit機閡 ： Deutsche Sammulung von Microorganismen あて名 ： Grisebachstrasse 8, D - 3400 Gbttingen , Federal
    [0258] —Republic of Germany
    [0259] 受託番号及び寄託した曰付 ：
    [0260] 6. DSM 4186 1987年 7月 2 2 日
    [0261] 7. DSM 4187 1987年 7月 2 2 日
    [0262] 8. DSM 4188 1987年 7月 2 2 日
    [0263] 9. DSM 4189 , 1987年 7月 2 2 日
    权利要求:
    Claims
    1. 次の式 ：
    (Met) . Ser1 - X156 . Y157 . Ζ158 - (式中、 MeUま場合によっては存在するメ チォニンであり
    Ser は N末端の 1 位に存在するセ リ ンであり 、 Xは 156位に 存在するアルギニン又請は他のア ミ ノ酸であり、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グリ シン、 ァラニン又はバリ ンであり、
    4の
    Zは 158位に存在する リ ジン又 3はアルギニンであり、 そ して 実線部分は天然型ヒ ト ープロゥ ロキナーゼ又は 135位の リ ジ 囲
    ンが塩基性ァ ミ ノ酸以外のア ミ ノ酸に変更されたヒ ト ープロ ゥ 口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列の対応する部分 と同一のア ミ ノ酸配列である。 ）
    で表されるア ミ ノ酸配列、 又はこれと実質上同一のア ミ ノ酸 配列を有する ヒ ト ープロゥ ロキナーゼ様ポ リ ペプチ ド。
    2. 前記天然ヒ ト ―プロウ 口キナーゼのア ミ ノ酸配列がヒ ト ー腎臓由来の m R N Aに対応する c D N Aによ り コ — ドさ れているア ミ ノ酸配列である請求の範囲第 1 項のポリ べプチ
    3. X 156 がアルギニンであり 、 Υ 157 がプロ リ ンであり， そして Ζ 158 がリ ジンである請求の範囲第 1 項に記載のポリ ぺプチ ド。
    4. X 156 がアルギニンであり 、 Υ 157 がプロ リ ンであり 、 そして Ζ 158 がアルギニンである請求の範囲第 1 項に記載の ポリ ペプチ ド。 '
    5. X 156 がグルタ ミ ンであり、 Y 157 がプロ リ ンであり . そして Z 158 がアルギニンである請求の範囲第 1項に記載の ポリ ペプチ ド。
    6. X 156 がセリ ンであり、 Yがグリ シンであり、 そして Z 158 がアルギニンである請求の範囲第 1項に記載のポ リ べ プチ ド。
    7. 次の式：
    (Met) - Set1 -X1 56 · Y157 · Ζ158 -
    (式中、 Metは場合によっては存在するメチォニンであり - Ser は N末端の 1位に存在するセリ ンであり、 は 156位に 存在するアルギニン又は他.のア ミ 酸であり、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グリ シ 、 、 ァラニ ン又はバリ ンであり、 Zは 158位に存在する リ ジ ン又ばアルギニ ンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト -プロゥロキナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ァ ミ ノ酸以外のァミノ酸に変更されたヒ ト—プロ ゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドのァ ミノ酸配列の対応する部分 と同一のアミノ酸配列である。 ）
    で表されるアミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のア ミノ酸 配列を有するヒ ト ープロウ口キナーゼ様ポリべプチ ドをコ一 ドする D N Aセグメ ン ト。
    8. N末端の複数個のア ミノ酸、 135位のア ミノ酸、 155 位のプロ リ ン並びに前記 X , Y及び Zをコー ドするコ ド ン以 外のコ ドンがヒ ト腎臓由来の m R N Aに対応する · c D N Aの ア ミノ酸のコ ドンと同一である請求の範囲第 Ί項記載の D N Aセグメ ン ト c -
    9. 前記 N末端の複数個のア ミ ノ酸をコ ー ドするコ ド ンが 次のコ ドン ：
    Met Ser Asn Glu Leu His Gin Val Pro Ser
    5 ' ATG AGC AAC GAG CTC CAC CAG GTT CCG TCG 3 ' 5 3 ' TAC TCG TTG CTC GAG GTG GTC CAA GGC AGC 5 '
    からなる請求の範囲第 Ί項記載の D N Aセグメ ン ト。
    10. 155位のプロ リ ンをコ 一 ドするコ ドンが CCTでコ ー ド されている請求の範囲第 7 項記載の D Ν Αセグメ ン ト。
    11. Xがアルギニ ンである場合、 これがコ ド ン AGG又は 0 CGT でコ 一 ドされており ； Xがグルタ ミ ンである場合、 これ がコ 'ド ン CAGでコ ー ドされており ； Xがセ リ ンである場合、 これがコ ド ン AGCでコ ー ドされており ； Yがプロ リ ンである 場合、 これがコ ドン CCT又は CCGでコ ー ドされており ； Yが グリ シンである場合、 これがコ ドン GGCでコ — ドされており5 Zがリ ジンである場合、 これがコ ドン AAAでコ ー ドされてお り ； そ して Zがアルギニンである場合、 これがコ ドン CGGま たは CGAでコ ー ドされている請求の範囲第 Ί項記載の
    D N Aセグメ ン ト 。
    12. 次の式 ：
    0 (Met) · Ser 1 - X1 56 · Y1 57 · Z1 58 -
    (式中、 Metは場合によっては存在するメ チォニ ンであり 、 Ser は N末端の 1 位に存在するセ リ ンであり 、 Xは 156位に - 存在するアルギニ ン又は他のア ミ ノ 酸であり 、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グ リ シ ン、 ァ ラニ ン又はバリ ンであり、5 Z は 158位に存在する リ ジ ン又はアルギニ ンであり 、 そ して 実線部分は天然型ヒ トープロゥロキナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ァ ミノ酸以外のァ ミノ酸に変更されたヒ ト—プロ ゥロキナ—ゼ様ボリ ぺプチ ドのァミノ酸配列の対応する部分 と同一のアミノ酸配列である。 ）
    で表されるアミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミノ酸 配列を有するヒ トープロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドをコー ドする D N Aセグメ ン ト、 その発現のための制御領域及び大 腸菌^で複製するのに必要な D A配列を含有するプラス ミ
    ，：-
    13. PMUT9Q-RPK , pMUT9Q-RPR , pMliT9Q - &PR又は ρ 1ϋ - SGR である請求の範囲位 1 2項に記載のプラスミ ド。
    14. 次の式 ： -
    (Met) · Ser1— X156 · Y157 · Ζ158 - _
    (式中、 Metは場合によっては存在する人チォ二ンであり Ser ば N末端の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニン又は他のア ミノ酸であり、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グリ シン、 ァラニン又はバリ ンであり、 Zは 158位に存在する リ ジ ン又ばアルギニ ンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト ―プロウ口キナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ア ミノ酸以^のア ミ ノ酸に変更されたヒ ト -プロー ゥ口キナーゼ様ポリぺプチ ドのァ ミノ酸配列の対応する部分 と同一のア ミノ酸配列である。 ）
    で表されるァ ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミノ酸 配列を有するヒ ト —プロゥ ロキナ一ゼ様ポリ ペプチ ドをコー ドする D N Aセグメ ン ト、 その発現のための制: ϋ領域及び大 腸菌中で複製する のに必要な D N A配列を舍有するプラ ス ミ ドにより形質転換された大腸菌。
    15. ェ シェ リ シャ · コ リ (Escherichia coli) JM 103/ pMUT9Q- PK(DSM4187) である請求の範囲第 1 4項に記載の大
    16. ェ シエ リ シャ . コ リ (Escherichia col i) JM 103Z PMUT9Q-RPR(DSM4186) である請求の範囲第 1 4項に記載の大
    4
    17. ェ シエ リ シャ · コ リ (Esc 7herichia col i) JM 103/ pMUT9Q-QPR(DSM4188) である請求の範囲第 1 4項に記載の大
    18. ェ シェ リ シャ ♦ コ リ (Escherichia coli) JM 103/ PMUT9Q-SGR(DSM4189) である請求の範囲第 1 4項に記載の大
    19. 次の式 ：
    (Met) . Ser3— X156 , Υ157 . Ζ158 -
    (式中、 Metは場合によっては存在するメ チォニ ンであり Ser は N末端の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニ ン又は他のア ミノ酸であり、 Yは 157位に 存在する プロ リ ン、 グリ シ ン、 ァ ラ ニ ン又はノ ' リ ンであり、 Zは 158位に存在する リ ジ ン又はアルギニ ンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト -プロウ πキナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ア ミノ酸以外のア ミノ酸に変更されたヒ ト -プロ ゥロキナーゼ様ポリ ぺプチ ドのァ ミ ノ酸配列の対応する部分 と同一のア ミノ酸配列である。 ） で表されるァ ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミノ酸 配列を有するヒ ト —プロウ口キナーゼ様ポリ ぺプチ ドをコ一 ドする D N Aセグメ ン ト、 その発現のための制御領域及び犬 腸菌中で複製するために必要な D N A配列を舍有するプラス ミ ドにより形質転換された大腸菌を培養し、 そして培養物か ら前記ボリぺプチ ドを採取することを特徴とするヒ トープロ ゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドの製造方法。
    20. 次の式 ：
    (Met) - Ser1 -X156 - Y157 - Z158- (式中、 Metは場合によっては存在するメ チォニンであり
    Ser は N末端の 1位に存在するセリ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニン又は他のア ミノ酸であり、 Yは 157位に 存在するプロリ ン、 グリ シ ン、 ァラニン又はバリ ンであり、 Zは 158位に存在する リ ジ ン又ばアルギニ ンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト -プロゥ口キナーゼ又は 135位のリ ジ ンが塩基性ァ ミノ酸以外のァ ミノ酸に変更されたヒ ト -プロ ゥ ロキナーゼ様ポリ ペプチドのァ ミノ酸配列の対応する部分 と同一のァミノ酸配列である。 ）
    で表されるァ ミノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァミノ酸 配列を有するヒ トープロゥロキナーゼ様ポリ ペプチ ドを常用 の医薬担体、 及び場合によっては他の医薬活性成分と共に舍 んで成る医薬。
    21. 血栓の形成に対する予防又は治療のための請求の範囲 第 2 0項に記載の医薬。
    22. 血栓の形成に対する予防又は治療のための医薬の製造 のための、 次の式 ：
    (Met) · Ser 1 - X156 · Y157 · Ζ158 -
    (式中、 Metは場合によつては存在するメ チォニンであり Ser は N末端の 1 位に存在するセ リ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニ ン又は他のア ミ ノ酸であり 、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グリ シン、 ァラニン又はバリ ンであり、 Z は 158位に存在する リ ジ ン又はアルギニ ンであり、 そ して 実線部分は天然型ヒ ト -プロゥ ロキナーゼ又は 135位の リ ジ ンが塩基性ァ ミ ノ酸以外のア ミ ノ酸に変更された ヒ ト -プロ ゥ ロキナーゼ様ポリ ペプチ ドのア ミ ノ酸配列の対応する部分 と同一のア ミ ノ酸配列である。 ）
    で表されるァ ミ ノ酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミ ノ 酸 配列を有する ヒ ト ―プロウ 口キナーゼ様ポリ べフ' -チ- の使用,
    23. 次の式 ：
    (Met) · Ser1 -X156 · Υ157 · Ζ158—
    (式中、 Me tは場合によっては存在するメ チォニ ンであり - Ser は N末端の 1 位に存在するセ リ ンであり、 Xは 156位に 存在するアルギニ ン又は他のア ミ ノ酸であり、 Yは 157位に 存在するプロ リ ン、 グ リ シ ン、 ァラニ ン又はパリ ンであり 、 Z は 158位に存在する リ ジ ン又はアルギニ ンであり、 そして 実線部分は天然型ヒ ト ープロゥ ロキナーゼ又は 135位の リ ジ ンが塩基性ァ ミ ノ酸以外のァ ミ ノ酸に変更されたヒ ト -プロ ゥ ロキナーゼ様ポリ ペプチ ドのァ ミ ノ 酸配列の対応する部分 と同一のァ ミ ノ酸配列である。 ）
    で表されるァ ミ ノ 酸配列、 又はこれと実質上同一のァ ミ ノ酸 配列を有する ヒ ト ―プロウ口キナーゼ様ポリ ペプチ ドを患者 に投与することを特徴とする血栓の形成に対する予防または 治療方法。
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    1989-02-23| AK| Designated states|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AU BB BG BR DK FI HU JP KR LK MC MG MW NO RO SD SU US |
    1989-02-23| AL| Designated countries for regional patents|Kind code of ref document: A1 Designated state(s): AT BE BJ CF CG CH CM DE FR GA GB IT LU ML MR NL SE SN TD TG |
    1989-04-18| WWE| Wipo information: entry into national phase|Ref document number: 1988907361 Country of ref document: EP |
    1989-09-06| WWP| Wipo information: published in national office|Ref document number: 1988907361 Country of ref document: EP |
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    JP20414987||1987-08-19||
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    AT88907361T| AT98990T|1987-08-19|1988-08-18|Menschlicher prourokinase aehnliches polypeptid.|
    DK187589A| DK187589D0|1987-08-19|1989-04-18|Hurtigtvirkende prourokinase|
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